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Name Specifications Packing Price Delivery
50T Inquiry 現(xiàn)貨
100T Inquiry 現(xiàn)貨
Character:
試劑盒組份
組份 (50T)  (100T)
Lysis Buffer 50 mL 100 mL
Mito-Wash Buffer 25 mL 50 mL
Store Buffer 5 mL 10 mL
Quality Standard:
說(shuō)明

線粒體提取試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體。適合于動(dòng)物軟組織(肝或腦組織)和硬組織(肌肉)以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高,可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。

三,操作步驟

1. 樣本處理

a. 組織勻漿:稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等,PBS或生理鹽水沖洗,洗凈血水,濾紙吸干,用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer,0℃冰浴上下研磨組織20次;

b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿:消化細(xì)胞,PBS洗滌,800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5 × 107個(gè)細(xì)胞,加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi),0℃冰浴研磨30~40次;

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管,4℃,1000× g 離心5 min;

3. 取上清,加入一新的離心管中,4℃,1000× g 再次離心5 min。

4.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 12,000 × g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分,可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,線粒體沉淀在管底;

5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀,4℃,1000× g 離心5 min;

6.取上清,加入一新的離心管中,4℃, 12,000 × g 離心10 min。棄上清,高純度的線粒體沉淀在管底;

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀,立即使用或-70℃保存。

四 注意事項(xiàng):
1. 為保證獲得完整的線粒體,第一是全程低溫操作。第二是快速。第三,在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比,培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁,因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度,不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
3. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳,可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體。

Storage:
四周內(nèi)使用可4℃儲(chǔ)存,長(zhǎng)期置-20℃

轉(zhuǎn)速與離心力換算

  G=1.11×(10-5)×R×[rpm]2
   G為離心力,一般以g(重力加速度)的倍數(shù)來(lái)表示;

   [rpm] 2即:轉(zhuǎn)速的平方; R為半徑,單位為厘米

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